Metoda Cepat dan Akurat Deteksi Bakteri Patogen Menggunakan Real Time PCR – Foodproof® Biotecon

Untuk pengujian bakteri patogen ataupun bakteri pencemar, terutama pada produk makanan dan minuman, kecepatan dan ketepatan analisa menjadi hal yang tidak dapat dikompromikan. Sampai saat ini metoda pendeteksian bakteri patogen dan pencemar yang umum digunakan adalah metoda mikrobiologi konvensional dengan cara mengamati ada tidaknya pertumbuhan bakteri tertentu pada media kultur agar mikrobiologi. Media kultur mikrobiologi memang masih digunakan sebagai ‘Gold Standar’ dalam pengujian mikrobiologi, terutama pada laboratorium ‘Quality Control’ di industri makanan dan minuman serta produk farmasi. Hanya saja kelemahan dari metoda tersebut antara lain lamanya waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan hasil, rata-rata bisa mencapai 3 – 4 hari untuk analisa bakteri patogen. Selain itu adanya keterbatasan dalam selektifitas dan sensitifitas dari jenis media kultur selektif juga membuat hasil pertumbuhan yang terdapat pada media agar harus diuji kembali untuk memastikan (uji konfirmasi) yang juga memakan waktu cukup lama antara 2 – 3 hari, agar terhindar dari hasil positif palsu ataupun hasil negatif palsu. Sehingga, seringkali lamanya waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan hasil secara lengkap dan dapat terpercaya mengenai ada/tidaknya cemaran mikrobiologi dari bagian QC membuat produk tidak dapat segera didistribusikan ke pasar. 

Saat ini Merck, sebagai salah satu produsen terbesar dan terdepan di bidang analisa mikrobiologi di dunia dan di Indonesia, memiliki 1 rangkaian terlengkap untuk solusi terbaik dan terpercaya deteksi cepat bakteri patogen. Awal tahun 2008 yang lalu, Merck secara resmi memperkenalkan reagensia untuk deteksi bakteri patogen secara cepat dan akurat yang menggunakan metoda analisa dengan Real Time PCR. Rangkaian reagensia tersebut berada dalam grup produk dengan nama foodproof® Biotecon. Dengan menggunakan metoda analisa Real Time PCR, hasil analisa keberadaan bakteri patogen dapat diperoleh keesokan hari setelah melewati 1 tahap saja pengayaan di media Buffered Peptone Water (BPW) selama ± 18 jam. Hasil yang diperoleh pun lebih akurat karena level deteksinya adalah DNA spesifik dari bakteri patogen tersebut.

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Jika dialih bahasakan ke dalam Bahasa Indonesia menjadi reaksi berantai menggunakan aktivitas enzim Polymerase. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil.

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–50 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut ini adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi.                                                                   
   Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96°C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing.                                                                                     
   Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi.                                                                                         
   Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase (P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76°C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
   Setelah tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Tahap 4 pada gambar menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.

Gambar 1. Reaksi PCR

Real Time PCR adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction), adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa. 

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis (Gambar 2. dan Gambar 3.). Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.

Gambar 2. Metode menggunakan SYBR® Green

Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metoda kuantifikasi yang umum digunakan antara lain : (1) menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green, dan (2) probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.

Metoda pertama adalah metoda yang paling mudah dengan menggunakan zat pewarna yang nantinya akan berikatan dengan setiap DNA untai ganda (dsDNA) yang dihasilkan dari reaksi PCR. Zat pewarna yang umum digunakan adalah SYBR® Green I. Zat pewarna ini pada kondisi bebas tidak berikatan dengan dsDNA memiliki energi/sinyal flouresensi yang rendah meskipun distimulasi oleh sinar yang ditembakkan oleh alat.  Pada saat terbentuk dsDNA sebagai hasil PCR, SYBR® Green akan berikatan dengan dsDNA membentuk suatu kompleks DNA-dye dan secara simultan akan meningkatkan sinyal fluoresensi pada saat disinari cahaya oleh alat. Penggunaan SYBR® Green menjadi populer pada awalnya karena harganya relatif murah, cukup menggunakan 1 jenis primer, dan dapat digunakan untuk hampir seluruh jenis analisa. Hanya saja, saat ini penggunaan SYBR® Green semakin kurang diminati. Sebab, SYBR® Green berikatan dengan ’sembarang’ dsDNA misalnya dengan primer-dimer maupun hasil PCR yang tidak sesuai. Hal tersebut menyebabkan hasil analis Real Time PCR menggunakan SYBR® Green yang menunjukkan hasil posiif deteksi DNA bakteri pathogen harus dikonfirmasi ulang menggunakan metoda konvensional mikrobiologi. Sebab, ada kemungkinan hasil positif tersebut adalah positif palsu. ISO 22119 [1] Draft saat ini sudah tidak lagi merekomendasikan penggunaan SYBR® Green pada analisa Real Time PCR untuk deteksi bakteri patogen pada produk pangan dan pakan ternak.

 Gambar 3. TaqMan® Probe (disamping)

Metoda kedua adalah penggunaan probe berfluoresensi sebagai pengirim sinyal pada reaksi Real Time PCR. Metoda tersebut menjadi yang paling terpercaya saat ini. Probe khusus tersebut menggunakan sekuens-spesifik dari RNA atau DNA tertentu untuk menghitung hanya kopi-kopi DNA yang mengadung sekuens spesifik tertentu tersebut. Oleh karena itu penggunaan probe khusus berfluoresensi tersebut secara signifikan meningkatkan spesifisitas dan memungkinkan dapat dilakukannya kuantifikasi meskipun terdapat beberapa amplikon DNA yang tidak spesifik. Hal ini juga memungkinkan untuk dilakukan esai multiplex untuk beberapa gen sekaligus pada reaksi yang sama dengan menggunakan probe spesifik dengan label warna yang berbeda, dengan demikian seluruh gen dimungkinkan untuk teramplifikasi dengan efisiensi yang seragam. Ada 2 jenis probe berfluoresensi yang populer digunakan dalam analisa Real Time PCR saat ini, yaitu (1) TaqMan® Probe/Hydrolisis Probe dan (2) Hybridization Probes. 
 
TaqMan® Probe atau juga dikenal sebagai Hydrolisis Probe awalnya dikembangkan oleh Applied Biosystem untuk meningkatkan spesifisitas analisa Real Time PCR. TaqMan probe terdiri atas sebuah fluorophore yang secara kovalen berikatan dengan sisi 5’- pada probe oligonukleotida dan sebuah quencher yang terikat pada sisi 3’-. Beberapa jenis fluorophore yang digunakan misalnya 6-carboxyfluorescein, disingkat: FAM, atau tetrachlorofluorescin, disingkat: TET. Sedangkan quencher yang umum digunakan misalnya tetramethylrhodamine, disingkat: TAMRA, atau dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder, disingkat : MGB. TaqMan Probe didesain sedemikian rupa sehingga dapat berikatan pada wilayah tertentu yang diinginkan di DNA menggunakan sepasang primer spesifik. Ketika enzim Taq Polymerase memperpanjang primer dan mensintesis untai DNA baru, aktivitas enzim exonuclease 5’-3’ dari polymerase akan memecah probe yang berikatan pada templat DNA. Pemecahan probe tersebut mengakibatkan terpisahnya fluorophore dari quencher yang meningkatkan sinyal fluoresensi dari fluorophore tersebut.  Sama halnya dengan metoda Real Time PCR lainnya, sinyal flouresensi yang dihasilkan sebagai hasil dari proses hibridisasi akan ditangkap oleh alat dan diakumulasikan untuk kemudian diukur intensitasnya secara eksponensial setiap siklus PCR selesai dilaksanakan. Nama TaqMan® Probe sendiri terinspirasi dari sebuah nama permainan videogame yaitu PacMan, Taq Polymerase + PacMan = TaqMan, dimana secara prinsip mekanisme TaqMan Probe memang mirip seperti alur permainan PacMan tersebut.
 

 Gambar 4. Hybridization Probe (disamping)

Metoda yang berikut adalah Hybiridization Probe (Gambar 4). Metoda in imenggunakan 2 jenis Probe yang telah dilabel oleh pewarna berfluoresensi.  Probe yang digunakan biasanya berupa satu  fragmen DNA atau RNA dengan ukuran pada umumnya 100-1000 basa. Probe ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA target (sekuense nukleotida tertentu) yang merupakan pasangan dari sekuens yang terdapat pada probe. Probe tersebut akan terhibridisasi ke DNA untai tunggal yang basa-basanya merupakan pasangan dari basa-basa probe tersebut. Satu probe akan dilabel menggunakan fluorescein di sisi 3’- nukleotida yang berfungsi sebagai donor fluorophore. Sedangkan probe yang kedua akan diberikan label berupa fluorophore LightCycler Red-640 atau LightCycler Red-705  di sisi 5’- nukleotida yang berfungsi sebagai akseptor fluorophore. Apabila DNA target ditemukan pada DNA sampel, maka fluorescein dan LightCycler Red akan berdekatan, sehingga pada saat ditembakkan cahaya dengan panjang gelombang 470 nm oleh alat akan timbul sinyal fluoresensi. Sinya fluoresensi yang timbul tersebut akan ditangkap dan diakumulasikan oleh alat secara eksponensial setiap kali 1 siklus PCR selesai dilakukan.

Foodproof® Biotecon reagen Real Time PCR dari Merck – KGaA tersedia dalam dua jenis probe, TaqMan dan Hybridization Probe. Dengan probe tersebut hasil analisa yang diperoleh menjadi lebih akurat dan spesifik bila dibandingkan dengan reagensia yang hanya menggunakan SYBR Green sebagai probenya. Adapun parameter pemeriksaan yang dapat dilakukan menggunakan foodproof® Biotecon antara lain :
a. Enterobacter sakazakii
b. Salmonella
c. E. coli 0157
d. Campylobacter
e. Listeria monocytogenes
f. Listeria spp.
g. Genetically Modified Organisms (GMO)
h. Beer Spoilage
 
Selain reagensia kit untuk deteksi, foodproof® Biotecon juga menyediakan reagensia untuk ekstraksi DNA dari sampel makanan, minuman ataupun yang berasal dari lingkungan. Sampel reagensia tersebut telah teruji kemampuannya terhadap beberapa jenis matriks sampel makanan dan minuman. Beberapa badan internasional pun telah memberikan rekomendasi untuk digunakannya foodproof® Biotecon dianalisa Real Time PCR antara lain AOAC, NordVal, Health Canada, AFNOR, dan MicroVal. Dengan menggunakan analisa Real Time PCR foodproof® Biotecon pengguna tidak perlu khawatir mendapatkan hasil positif palsu, karena probe yang digunakan sudah didesain sedemikian rupa sehingga spesifik terhadap target DNA yang dicari. Sesuai dengan ISO 22119 [1], untuk pengguna Real Time PCR yang menggunakan SYBR® Green apabila mendapatkan hasil positif harus mengkonfirmasi kembali menggunakan media kultur mikrobiologi. Jika demikian, tujuan utama untuk mempercepat waktu analisa dengan hasil yang akurat tidak tercapai. Namun, dengan menggunakan foodproof® Biotecon yang menggunakan probe TaqMan ataupun Hybridization hasil analisa yang diperoleh jauh lebih akurat dan dapat dipercaya.

Secara garis besar alur kerja menggunakan Real Time PCR dari foodproof® Biotecon dapat dilihat dibagan berikut:

Untuk informasi lebih detail mengenai informasi di atas, silakan menghubungi PT Merck Tbk di (021) 28565600 atau toll free 0 800 1401253. *(GS)

Informasi Produk (silahkan klik no.katalog berikut ini untuk mengetahui produk-produk dari foodproof® Biotecon) :