24-Apr-2009

Hasil Akurat dan Keterulangan yang Memuaskan pada Amplifikasi Real-Time menggunakan NovaTaq™ Hot Start Master Mix

Metode-motode PCR Real-Time digunakan untuk menentukan tingkatan mRNA yang spesifik atau urutan-urutan DNA. Metode-metode real-time ini digunakan dalam beberapa aplikasi yang berbeda-beda termasuk dalam menganalisa ekspresi gen, studi genotip and deteksi patogen. Kami telah berhasil mendemonstrasikan dimana NovaTaq™ Hot Start Master Mix dapat digunakan di dalam amplifikasi PCR Real-Time untuk variasi templet-templet dalam menentukan hasil-hasil keterulangan dan hasil amplifikasi yang akurat dari gen-gen copy jumlah pendek. Di dalam artikel ini, perbandingan terhadap beberapa kompetitor PCR memperlihatkan NovaTaq™ Hot Start Master Mix memberikan dan menampilkan amplifikasi yang tinggi dan spesifik¹.

 

Amplifikasi PCR Real-Time dari cDNA dengan NovaTaq™ Hot Start Master Mix

PCR Real-Time dilakukan menggunakan plasmid linierisasi mengandung glycogen synthase kinase 3 alpha (GSKa) cDNA. Stok DNA pada 5x10⁸ kopi/µl didilusi 10-fold secara serial di TE dan reaksi-reaksinya dijalankan dalam rangkap tiga. Parameter-parameter yang digunakan dalam Sistem Deteksi PCR Real-Time Chromo4 berikut ini adalah (Bio-Rad): denaturisasi awal pada 95°C selama 10 menit; diikuti dengan 94°C selama 30 detik; diikuti dengan 54°C selama 30 detik, dan 72°C selama 10 detik untuk 45 siklus. Primer dirancang untuk target 112 pasang basa amplikon GSK3a. DNA dideteksi menggunakan probe HEX-labeled.

Panel A memperlihatkan kurva amplifikasi untuk PCR Real-Time dan kemampuan keterulangan hasil menggunakan NovaTaq™ Hot Start Master Mix diatas batas konsentrasi templet. Pada Panel B, ambang siklus (Ct) diplot terhadap konsentrasi DNA. Korelasinya menunjukkan bahwa NovaTaq™ Hot Start Master Mix memberikan hasil-hasil yang linier untuk 10 hingga 10⁹ kopi plasmid.

 

Amplifikasi PCR Real-Time dari DNA genomik manusia dengan NovaTaq™ Hot Start Master Mix

DNA genomik manusia (Cat. No. 69237) secara serial didilusi 10-fold di dalam TE (10mM Tris, pH 8) dari 50 ng/µl. Primer dirancang untuk target 139 pasang basa amplikon GSKa. Profil siklus menggunakan Sistem Deteksi PCR Real-Time Bio-Rad Chromo4 adalah: denaturasi pada temperatur 95°C selama 10 menit; diikuti dengan 94°C selama 30 detik, 54°C selama 30 detik, dan 72°C selama 10 detik untuk 45 siklus. DNA yang dideteksi tersebut menggunakan probe HEX-labeled. Seluruh reaksi dilakukan dalam rangkap tiga. Amplifikasi terlihat pada gambar dimana per reaksi muncul 3 pengkopian yang diindikasikan di dalam kurva amplifikasi¹. Ct terhadap konsentrasi DNA menunjukkan hasil yang linier untuk 0.01 hingga 100 ng DNA genomik. Catatan disini bahwa 0.001 ng korelasi sekitar 0.3 kopi urutan target dan satu dari 3 eksperimen dilakukan dalam rangkap 3 yang memberikan sinyal yang mana dua eksperimen yang lain menunjukkan hasil yang negatif.

 

Performansi NovaTaq™ Hot Start Master Mix dalam kuantitatif PCR terhadap kompetitornya.

Total RNA yang diisolasi dari sel-sel 3T3 dan cDNA tikus disintesis menggunakan MMLV transkrip balik. Daerah 122 pasang basa dari urutan pengkodean b-actin tikus diamplikasi dari 15 ng/µl cDNA menggunakan NovaTaq™ Hot Start Master Mix atau qPCR dari perusahaan pesaingnya. DNA dideteksi menggunakan SYBR® Green dye. Setiap reaksi dilakukan dalam rangkap 3. Parameter-parameter yang dipakai atau digunakan debfab Corbett Rotorgene 6000: denaturisasi awal pada 95°C selama 10 menit, diikuti dengan 95°C selama 10 detik, 55°C selama 15 detik, dan 72°C selama 20 detik untuk 40 siklus. Kurva amplifikasi terlihat bahwa analisis cair telah dilakukan pada daerah temperatur 60°C dan 99°C, yang tampil pada setiap derajat¹. Puncak tunggal di kurva cair mendemontrasikan spesifikasi reaksi. Puncak-puncak yang berualng juga mengindikasikan produk kedua juga diamplikasi dan memperlihatkan hasil yang akurat.

 

Kesimpulan

Kami telah mendemonstrasikan NovaTaq™ Hot Start Master Mix dapat digunakan pada PCR Real-Time untuk sampel-sample plasmid, genomic dan untai tunggal cDNA. Data yang dihasilkan menggunakan enzim primer dilakukan untuk gen-gen jumlah kopi pendek. NovaTaq™ Hot Start Master Mix memiliki efisiensi amplifikasi dan spesifikasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan beberapa pesaing dikelasnya.

 

¹ Hope Schultz and Keith Yaeger, PCR Tools, 2nd ed., EMD Biosciences, 2009

 

kembali